Сюжет в The Binding of Isaac основан на одноимённой библейской истории. Маленький Исаак и его мать счастливо живут в маленьком домике на холме. Исаак рисует картинки и играет с игрушками, пока его мать смотрит христианские программы по телевизору. Мать Исаака неожиданно слышит «голос с небес», повествующий, что её сын осквернён грехами и должен быть спасён. Он просит женщину убрать всё зло от Исаака, чтобы его спасти. Мать повинуется и отбирает у сына все его игрушки, рисунки, игровую приставку, даже одежду, и судя по всему, делает ему обрезание.

Голос снова обращается к матери Исаака и говорит ей оборвать связь сына со злом мира сего. Она снова повинуется и запирает Исаака в его комнате. Но голос вновь к ней обратился. Он хвалит её за послушание, но он всё ещё не уверен в её преданности и требует принести Исаака в жертву. Она повинуется, хватает разделочный нож и направляется в комнату сына. Исаак, наблюдая за этим через трещину в двери, начинает паниковать. Он находит люк, спрятанный под ковром и сразу же в него прыгает, как раз в тот момент, когда мать открывает дверь.

На загрузочных экранах Исаак показан рыдающим в позе эмбриона. За его мыслями можно наблюдать. Они варьируются от отказа матери от сына и издевательств со стороны сверстников до сцены его собственной смерти. В игре 12 концовок.